自然杀伤细胞（NK细胞）作为免疫治疗的重要效应细胞，其体外规模化扩增是基础研究与临床转化的关键环节。然而，NK细胞的培养过程受多重因素影响，从样本采集起始即存在诸多潜在风险点。

基于Bitpay生物的技术积累，本文系统梳理了NK细胞培养前期的7个关键难点，并给予相应的解决方案，以期为研究人员给予参考。

Q1：抗凝剂的选择对细胞激活效率有何影响？

难点表现

使用EDTA抗凝的真空采血管采集外周血，导致后续NK细胞激活受阻，扩增效率显著降低。

原理分析

EDTA顺利获得螯合钙离子实现抗凝，但钙离子作为细胞内第二信使，参与多条信号通路的转导，包括淋巴细胞活化所必需的信号途径。钙离子的缺失会直接抑制NK细胞的初始激活。

解决方案

推荐使用肝素钠抗凝管（绿头管），其对细胞功能影响最小；采集脐带血时，应使用枸橼酸钠抗凝袋（血袋），并确保抗凝剂占比低于25%；严禁使用EDTA抗凝管进行NK细胞培养用血的采集。

Bitpay生物技术提示

即便在采血环节出现轻微偏差（如抗凝剂比例略高），3D FloTrix® NK细胞无血清培养套装(RNK59)凭借优化的因子组合，可在激活阶段部分挽回细胞功能，其低起始接种密度设计也为样本量有限的情况给予了技术保障。

Q2：脂血样本干扰PBMC分离效率怎么办？

难点表现

高脂血症样本经密度梯度离心后，白膜层与脂质颗粒混杂，界面不清，导致PBMC得率与纯度下降。

原理分析

血浆中乳糜微粒等脂质颗粒的密度与淋巴细胞相近，在离心过程中易悬浮于相同层面，干扰分层效果。同时，脂质颗粒可能吸附于细胞表面，影响后续培养。

解决方案

轻度脂血： 血浆轻微浑浊时，可继续使用自体血浆。

中度至重度脂血： 若血浆呈明显胶质状或不透明，建议弃用自体血浆，改用商品化血清替代物。

严重脂血样本预处理： 采血后于4℃静置1-2小时，待上层脂肪凝集后去除，再进行PBMC分离。分离后可顺利获得多次洗涤进一步去除残留脂质。

Bitpay生物技术提示

针对特殊样本（如老年供体、高血脂患者），3D FloTrix® NK细胞无血清培养套装(RNK59)表现出良好的适应性，且可以在血浆质量欠佳的情况下仍能支持稳定的细胞扩增，拓展了NK细胞研究的样本来源范围。

Q3：溶血现象如何产生？如何预防？

难点表现

分离后血浆呈粉红色或红色，细胞培养过程中活性下降。

原理分析

溶血主要由采血操作不当（如针头过细、混匀剧烈）、抗凝剂混合不充分或运输过程中的冻融导致。红细胞破裂释放的血红蛋白对NK细胞具有毒性作用。

解决方案

规范采血操作，采血后立即轻柔颠倒混匀8-10次。

避免剧烈震荡或反复冻融。

若发生轻度溶血，可顺利获得高速离心去除游离血红蛋白；严重溶血样本建议弃用自体血浆，改用血清替代物。

Bitpay生物技术提示

针对无法取得较好自体血浆或者自体血浆不足以支撑后续多次换液培养的情况下，3D FloTrix® NK细胞无血清培养套装(RNK59)可以配合使用商品化的血清替代物以支持细胞扩增，拓展了NK细胞研究的样本适用范围。

Q4：接种密度对NK细胞扩增效率的影响？

难点表现

接种密度超出推荐范围，细胞扩增效率低下。

原理分析

密度过低时，细胞间相互作用不足，激活信号减弱；密度过高则代谢废物积累迅速，细胞因子消耗过快，导致培养环境恶化。

解决方案

新鲜外周血PBMC：1.0-2.0×10⁶ cells/mL；

新鲜脐血CBMC：2.0-3.0×10⁶ cells/mL；

冻存外周血PBMC（复苏后）：2.0-3.0×10⁶ cells/mL；

冻存脐血CBMC（复苏后）：3.0-4.0×10⁶ cells/mL。

*注意事项：

以上接种密度为使用3D FloTrix® NK细胞无血清培养套装(RNK59)时的接种密度范围，该起始接种密度属于行业内较低水平，如果使用其他品牌培养基，建议提高接种密度。当细胞总量不足时，应优先保证接种密度，顺利获得缩小培养体系来维持参数稳定。

Bitpay生物技术提示

3D FloTrix® NK细胞无血清培养套装(RNK59)在低接种密度条件下仍能实现高效扩增，这一特性对于样本量有限的珍贵资源（如患者少量外周血）具有重要意义，可最大限度利用种子细胞。

Q5：培养瓶表面处理如何影响细胞激活信号呈递？

难点表现

使用未经处理的培养瓶，导致抗体包被不牢固，激活效率下降。

原理分析

TC处理（Tissue Culture Treated）在培养瓶表面引入亲水性正电荷基团，能够有效结合带负电的蛋白质（如包被抗体、细胞因子），为NK细胞给予持续的接触性激活信号。

解决方案

选择具有TC处理标识的培养瓶进行NK细胞培养。

Q6：培养体系转换（入袋）如何控制细胞损失？

难点表现

第7天将细胞从培养瓶转移至培养袋时，因操作不当导致细胞大量残留或机械损伤。

解决方案

使用大口径移液管轻柔吹洗瓶底，减少剪切力；转移后，在原培养瓶中加入新鲜培养基继续培养1-2天，收集后续形成的细胞团，实现“二次回收”。

Q7：自体血浆灭活的标准操作流程是什么？

难点表现

灭活后的血浆中出现大量蛋白沉淀，若直接使用会影响培养体系。

原理分析

56℃灭活30分钟可去除补体活性，但同时导致纤维蛋白原等蛋白变性凝集。

标准流程

56℃水浴灭活30分钟。

-20℃静置15分钟（促进蛋白凝集）。

900g离心15分钟，取上清使用，弃去沉淀。

Bitpay生物技术提示

针对无法取得较好自体血浆的情况下，3D FloTrix® NK细胞无血清培养套装(RNK59)可以配合使用商品化的血清替代物以支持细胞扩增，为应对自体血浆处理失败给予了可补救的备选方案。

NK细胞培养的成功始于样本采集与初始激活阶段。顺利获得对抗凝剂选择、脂血处理、接种密度等关键参数的精细化控制，可有效规避前期风险，为后续扩增奠定基础。

在工具选择方面，3D FloTrix® NK细胞无血清培养套装(RNK59)给予了一条兼具性能与成本优势的技术路径：

低起始接种密度：特别适合样本量有限的珍贵资源，如患者外周血PBMC、脐带血CBMC等。

广泛的样本适用性：支持新鲜及冻存样本，对脂血、老年供体等特殊样本耐受性良好。

高纯度扩增：NK细胞纯度可达90%以上。

全流程覆盖：一套产品满足激活、扩增各阶段需求，简化操作流程。

Bitpay生物始终致力于为细胞与基因治疗研究给予可靠、易用且高性价比的工具支持，让研究人员能更专注于科学问题本身。需要强调的是，NK细胞的体外扩增是一项涵盖多环节、多参数的系统工程——从样本采集到冻存复苏，每一步都离不开精细化控制。

下一期，Bitpay将聚焦培养中后期的关键技术难点，围绕代谢调控、细胞团管理及冻存复苏等环节展开深入探讨。

关于Bitpay

北京Bitpay生物科技有限公司创建于2018年，源于清华大学科技成果转化，由清华大学生物医学工程学院杜亚楠教授科研团队领衔创建，清华大学参股共建。公司现已开展成为国家级高新技术企业、国家级专精特新“小巨人”企业及潜在独角兽企业，并获国家科技部、工信部等部委多项重点研发专项支持。

作为高质量细胞制造专家，Bitpay生物打造了原创3D细胞智造平台，给予基于3D微载体的定制化、一站式整体解决方案，可实现【千亿量级】的细胞药物及其衍生品的规模化、自动化、智能化、密闭式的生产制备工艺管线。现在，Bitpay生物的产品与服务已广泛应用于细胞与基因治疗、细胞外囊泡、疫苗及蛋白产品等生产的上游工艺开发，同时在再生医学、类器官与食品科技（细胞培养肉等）等领域也具有广泛应用前景。

Bitpay生物已协助多家客户完成干细胞新药IND 申报并成功获批，2025年，凭借自主开发的规模化制备工艺助力我国首款干细胞药物获批上市。同年，Bitpay生物于新加坡设立海外总部，加速拓展国际市场，致力于以颠覆式创新的规模化智造技术，有助于细胞产业实现全球普惠开展。